標(biāo)簽：ELISA 抗原 血清 緩沖液 冰箱 恒溫培養(yǎng)箱 酶標(biāo)板 本生 二抗 培養(yǎng)板


　　ELISA實(shí)驗(yàn)| 操作材料儀器、步驟、注意事項(xiàng)、常見問題

　　材料儀器：

　　抗原、血清、碳酸鹽包被緩沖液、PBST

　　BSA、96 孔酶標(biāo)板、4 ℃ 冰箱

　　恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)

　　Elisa實(shí)驗(yàn)步驟：

　　一、包被抗原

　　1. 用 50 mM 的碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)溶解抗原，使抗原濃度為 10～20 μg/ml，加 100 μl/孔到 96 孔酶標(biāo)板，4 ℃ 放置過夜。

　　2. 第二天棄去包被液后，用 PBST 洗滌 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 ℃ 封閉 1 小時(shí)。

　　3. PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 ℃ 孵育 2 小時(shí)。

　　4. PBST 洗滌 5 次后，加入 100 μl 稀釋后的 HRP 標(biāo)記的二抗，37 ℃ 孵育 1 小時(shí)。

　　5. PBST 洗滌 5 次后，顯色劑顯色 20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值。

　　二、包被細(xì)胞

　　1. 在 96 孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為 1 x 104 cells/well，37 ℃ 過夜培養(yǎng)。

　　2. 第二天用 PBS 洗滌培養(yǎng)板 2～3 次。

　　3. 加入 125 μl/well 10% Forma lin(1:10 稀釋)， 室溫下固定 15 min。

　　4. 用 ddH2O 洗滌培養(yǎng)板 3 次，并晾干，儲(chǔ)藏在 2～8℃ 備用。

　　5. 用 PBST 洗滌 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 ℃ 封閉 1 小時(shí)。

　　6. PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 ℃ 孵育 2 小時(shí)。

　　7. PBST 洗滌 5 次后，加入 100 μl 稀釋后的 HRP 標(biāo)記的二抗，37 ℃ 孵育 1 小時(shí)。

　　8. PBST 洗滌 5 次后，顯色劑顯色 20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值。

　　50 mM 的碳酸鹽包被緩沖液：Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克， 蒸餾水稀釋至 100 m，調(diào)節(jié) pH 為 9.6，4 ℃，保存。

　　ABTS 作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng) (10 ml) ：0.2 M Na2HPO4 2.4 ml 0.1 M 檸檬酸 2.6 ml ddH2O 5 ml ABTS 5 mg H2O2 (30%) 4 ul(用前加入)。

　　注意事項(xiàng)：

　　血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性 HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法 ELISA 中可使本底加深。

　　一般說來，在 5 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于 4 ℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。

　　反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。

　　常見問題：

　　按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用 pH 計(jì)測量較正。

　　從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。

　　注：以上僅供參考！

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